Labor-Diagnostik, welche, wie und wann?

Informationsseite zur Diagnostik - wie man COVID-19 nachweist

Hinweis: Updates werden auf dieser Seite fortlaufend eingearbeitet.

Die SARS-CoV-2 Diagnostik erfolgt im akuten Stadium, im Verlauf der Erkrankung oder nach Abklingen der Symptome. Hierzu werden die jeweils geeigneten Verfahren zum diagnostischen Nachweis von COVID-19 - Infektionen als Beitrag zum Gesundheitsschutz bzw. Infektionsschutz angewandt. 

Nicht gezielte Tätigkeiten im Rahmen der Labordiagnostik (also PCR) sind unter Beachtung der Vorgaben des Ausschusses für biologische Arbeitsstoffe (ABAS) unter der Schutzstufe 2 durchzuführen, gezielte Tätigkeiten, bei der es zur Vermehrung replikationsfähiger Viren kommt (also Zellkulturverfahren), sind Laboren der Schutzstufe 3 vorbehalten.

Nachweis von akuten Infektionen

Das Standardverfahren zum Nachweis des Severe Acute Respiratory Syndrome Corona Virus 2 (SARS-CoV-2), des Erregers der COrona VIrus Disease 2019 (COVID-19) ist der Nachweis von Virus-RNA durch quantitative Real-Time PCR nach reverser Transkription. Dabei sind richtige Probenentnahme, Transport und Verarbeitung besonders wichtig. Allerdings ist dieser Nachweis auch dann nur zu Beginn der Krankheit zuverlässig. Die Polymerase-Kettenreaktion (kurz: PCR), im aktuellen Fall die sogenannte real time RT-qPCR, ist ein gut bekanntes Laborverfahren. Die Nukleinsäure des Virus wird unter einer Sicherheitswerkbank aus der eingesandten Probe eluiert (Präparationsreaktion) und gezielt vervielfältigt. Die eingesetzten Startmoleküle für die Reaktion passen exakt zu dem gesuchten Virus. Die Auswertung erfolgt maschinell. Somit kann geklärt werden, ob die vorhandene Symptomatik tatsächlich auf SARS-CoV-2 zurückzuführen ist. Es können auch Aussagen zu medikamentösen Behandlungen (die derzeit in zahlreichen klinischen Studien stattfinden: siehe "Therapieoptionen") gewonnen werden: Auch zum Verfolgen der Krankheitsentwicklung bei stationären Patienten wird die PCR derzeit eingesetzt.

Bleibt diese PCR auf SARS-CoV-2 negativ, sind weitere Untersuchungen zur Abklärung des ätiologischen Agens notwendig. Es gibt zahlreiche andere Ursachen (vor allem andere Viren) für ganz ähnliche Erkältungs- bzw. Lungenentzündungssymptome. Hierfür stehen wiederum andere molekularbiologische Methoden im Multiplex-Verfahren zur Verfügung.

Chinesische Arbeitsgruppen veröffentlichten zwischen dem 10. und 12. Januar 2020 insgesamt fünf Vollgenomsequenzen des neuen Coronavirus [1], wodurch die enge Verwandtschaft zum severe acute respiratory syndrom (SARS) CoV, welches für die SARS-Pandemie 2002/03 verantwortlich war, belegt werden konnte. Basierend auf in silico-Analysen schon bekannter Beta-Coronaviren und dann anschließende gestützt durch die Genomdaten von SARS-CoV-2 konnte sehr zeitnah durch Corman et al. ein erster molekularbiologischer Nachweis für das neuartige Coronavirus etabliert werden [2]. Die RT-PCR-Tests, die derzeit weltweit ab Januar 2020 zur Diagnose von akuten COVID-19 Infektionen eingesetzt werden, weisen das Vorhandensein von viralem Material (RNA) während der akuten Infektion nach, geben aber im Nachhinein keine Hinweise auf eine durchgemachte Infektion bzw. den Immunstatus. 

PCR-Protokolle zum Nachweis von SARS-CoV-2 wurden ab Anfang Januar 2020 etabliert. Die mittlerweile erhältlichen auch CE zertifizierten PCR-Kits enthalten spezifische Primer und Sonden. Die molekularbiologische Diagnostik  verläuft gem. den fachlichen Vorgaben in einem Stufenschema, wobei die Untersuchungen gleichzeitig ablaufen (können).

E Gen und RdRP Gen sind von der WHO empfohlene Zielsequenzen im Virusgenom. Das erste Assay (E Gen; envelope-Gen; Hüllprotein) dient als Screening und zielt auf RNA (cDNA) des Subgenus Sarbecovirus (SARS-verwandte Betacoronaviren) und ist sehr sensitiv.. Neben SARS-CoV-2 werden auch auch SARS-CoV und einige Fledermaus-assoziierte Coronaviren der Untergattung Sarbecovirus detektiert.

Der Bestätigungs-Assay zielt auf das RdRP Gen (Abschnitt des Gens für den RNA-abhängige RNA-Polymerase). Dieser Charakterisierungs-Assay detektiert SARS-CoV-2 sehr spezifisch. Dazu kommt noch das ebenfalls für SARS-CoV-2 spezifische N-Gen bzw.S Gen.

Weder der screening-Assay noch der Bestätigungs-Assay zeigen eine Kreuzreaktion mit anderen, schon bekannten humanpathogenen respiratorischen Coronaviren (CoV NL63, 229E, HKU, OC43 oder MERS).

Daneben finden sich noch das Orf-Gen und das M-Gen als Zielsequenz.

Der simultane Nachweis von 3 Zielsequenzen (RdRP Gen, S Gen/N-Gen und E Gen) erhöht die diagnostische Zuverlässigkeit auch im Falle von Mutationen in den Zielsequenzen.

Eine Kontroll-RNA (Internal Process Control, IPC) erlaubt im Rahmen der Testdurchführung die Überprüfung von Inhibitionen und dient als Kontrolle, dass die Nukleinsäure aus der Probe isoliert wurde.

Einige Testsysteme haben zusätzlich eine Internal System Control (ISC) im Testkit. Diese ISC dient zur Detektion  eines  "house keeping gene" (Beta-actin, multi species). Die ISC hilft falsch negative Ergebnisse zu verhindern, die aufgrund insuffizienter Probennahme oder durch nicht korrekten Probentransport auftreten können.

Eine Analyse dauert im Labor etwa 3-4 Stunden (reine Probenlaufzeit inkl. Probenaufbereitung, Aufreinigung, Extraktion der Nukleinsäure und das anschließende Reverse-Transkiptase (RT-) PCR). 

Point of care Testsysteme

Neben der bereits oben beschriebenen RT-qPCR, die einen hohen Anspruch an die Ausbildung des Laborpersonals stellt, sind seit einigen Jahren kompakte und vor allem einfach anzuwendende Testsysteme für die Nukleinsäureamplifikation erhältlich, die speziell für die Patienten-nahe Testung („point of care“) entwickelt wurde. Die kurze Laufzeit von teilweise unter einer Stunde ermöglicht gegebenenfalls eine schnelle Isolation der Patienten. Die Patientenprobe wird in der Regel direkt in die Testkartusche eingebracht, die alle Reagenzien für die Nukleinsäureaufreinigung und anschließendem Nachweis der SARS-CoV-2-RNA durch RT-qPCR als geschlossenes System enthalten. Testsysteme mehrere Hersteller besitzen bereits eine IVD-CE-Zertifizierung oder stehen kurz davor diese zu erhalten. Die Herstellerhinweise sind insbesondere auch bezüglich der Validierungsdaten und des erforderlichen Probenmaterials zu beachten.

 

Probenmaterial für die RT-qPCR-Tests

Die Inkubationszeit von COVID-19 beträgt 1-14 Tage (im Mittel 5-6 Tage). Als Probenmaterial für den direkten Erregernachweis mittels PCR eignet sich ein Rachen/Nasenabstrich (Nasopharyngealabstrich; Abstrich aus den oberen Atemwegen). Die Probennahme erfolgt mittels Abstrich-Tupfern. Die Rachenhinterwand wird abgestrichen, so dass von der oberen Schleimhautschicht einiges an Material mit Zellen entnommen wird. Beim Einführen des Tupfers über den Nasenboden ist es wichtig tief genug hinein zu gelangen. 

Auch Sputum wird zur  Diagnostik in der Akutphase ins Labor eingesandt (vor allem bei hospitalisierten Patienten mit heftiger Symptomatik).

In der späteren Infektionsphase (etwa ab der zweiten Woche nach Beginn der Symptome) ist Untersuchungsmaterial aus den unteren Atemwegen (Sputum, bronchoalveoläre Lavage, Trachealsekret) zu bevorzugen.

Zum Transport des  Probenmaterial eignets sich vor allem (Rachen/Nasenabstrich in) Viren-Transportmedium oder Sputum in dafür geeigneten Transportröhrchen. Bei Verwendung der Abstrich- und Transportsysteme ist darauf zu achten, dass sie den Nachweis durch molekularbiologische Techniken erlauben. Transportmedien für Viren sind gut geeignet und ermöglichen zudem die kurzfristige Lagerung bei 2-8°C.      

Wenn möglich, sollten sowohl Abstrichproben als auch Sputumproben je Patient eingesandt werden, um in allen Phasen des Erkrankungsgeschehens eine höchstmögliche Chance zum Nachweis des Erregererbguts zu gewährleisten. 

Zusätzlich ist die Entnahme von EDTA-Vollblut für eine spätere serologische Untersuchung möglich.

Serologiebasierte Tests für COVID-19

Da die PCR-Analyse zudem Zeit benötigt und Ansprüche an die Qualifikation des Personals sowie an Gerät und Arbeitsraum stellt (Dreiraumregel), wäre ein technisch einfacher, lokal durchführbarer, direkter Virus-Nachweis wünschenswert. Antigentests werden meist als Streifentests (Lateral-Flow) angeboten, die SARS-CoV-2 spezifisches Antigen im Untersuchungsmaterial nachweisen. Im akuten Stadium der Erkrankung bietet ein Antigennachweis eine weitere Möglichkeit den Erreger direkt aus dem Untersuchungsmaterial der oberen Atemwege nachzuweisen. Es handelt sich hierbei (meist) um in der Anwendung einfache Streifentests nach dem Lateral-Flow-Prinzip, bei denen monoklonale Antikörper gegen Oberflächenproteine des Viruspartikels wie das Nukleokapsidprotein und/oder die S1-Domäne des Spikeproteins verwendet werden. Erfahrungen mit diesen Tests liegen derzeit noch eher spärlich vor, die Sensitivitätswerte sind jedoch eher gering. Bei den Antigentests handelt es sich meist um Schnelltests, die nach etwa 15 Minuten nach Zugabe von Probenmaterial und Puffer ein (qualitatives) Ergebnis liefern. Bislang sind dafür aber keine Tests bekannt, für die eine ausreichende Qualität dokumentiert wäre. Teilweise gibt es eine Sensitivität von nur rund 60% (Stand Mai 2020)Dagegen ist der positiv prädiktive Wert mit >95% häufig sehr hoch. Der negativ prädiktive Wert ist stark von der Konzentration des Virus in der Probe abhängig und liegt oft unter 50%. 

Mittlerweile werden zahlreiche Antikörper-Tests (IgA; IgG; IgM) angeboten, die jedoch erst noch zu evaluieren sind (vor allem an ausreichend großen Stichproben und mit einem entsprechenden Prüfdesign). Zudem sind noch nicht alle dieser Tests CE-zertifiziert bzw. IVD gelabelt, sondern nur für wissenschaftliche Zwecke freigegeben (Research use only). Nach der Marktsichtung sowie Evaluierung bzw. Vorliegen zertifizierter und zugelassener Tests wissen wir mehr. Daher werden gerade erst Daten gewonnen, die helfen, die Performance der Tests einschätzen zu können (bevor sie guten Gewissens angeboten werden können). Diese Antikörpertests eignen sich nicht zur Akutdiagnostik, eine Asservierung von Serumproben zur späteren Beurteilung bietet sich jedoch ggf. an. Da verschiedene Corona-Viren (z.B. als Erreger von Erkältungskrankheiten) weit verbreitet sind, ist es nicht zuletzt wichtig, dass solche Tests auch ausreichend spezifisch sind. Zur Sensitivität und Spezifität von Antikörpertests siehe beispielsweise Kohmer et al. 2020.

Mit diesen Antikörpertests will man untersuchen, wie der Patient auf die Infektion reagiert hat, ob er Antikörper gebildet hat. Diese Antikörper wiederum binden gegen bestimmte Komponenten des Virus. In der Regel werden daher bei der Testentwicklung künstlich hergestellte Proteinbausteine des Virus eingesetzt. Diese Bausteine werden dann mit Patientenserum in Verbindung gebracht. Sind Antikörper vorhanden (im Falle einer Infektion etwa ab der zweiten Woche nach Beginn der Symptome), binden sie im Labortest an diese Erregerkomponenten in den Testkomponenten. Es folgt die Nachweisreaktion, die (im positiven Falle) als Ergebnis das Vorhandensein von spezifischen Antikörpern ergibt. Sind Antikörper nachgewiesen, bedeutet dies, dass die Infektion bereits fortgeschritten ist bzw. sogar abgelaufen ist. Aus einer solchen Untersuchung kann abgeleitet werden, ob der Patient ggf. immun ist und sich evtl. so schnell nicht wieder infiziert. Je nach verwendetem Test können Antikörper der Klassen IgA, IgM und IgG differenziert werden. Bei einer Infektion mit SARS-CoV-2 können innerhalb oder zum Ende der zweiten Krankheitswoche IgG-spezifische Antikörper nachgewiesen werden, Antikörper vom Typ IgM und IgA einige Tage früher. Antikörpertests sollen außerdem im Rahmen von Studien Auskunft über das Ausmaß der Pandmie in der Bevölkerung Sicherheit schaffen. Zudem werden Antikörpertests auch für die Testung von Spendern des Rekonvaleszenzplasmas gebraucht sowie für die Wirksamkeitskontrolle bei der Entwicklung von Impfstoffen.

Diese Antikörpertests sind daher für SARS-CoV-2 sind derzeit sehr gefragt, um die tatsächliche Anzahl der Infektionen mit COVID-19 ermitteln zu können (Ende Juni 2020 waren in Deutschland mehr als 150 verschiedene Tests registriert). Und zwar sowohl diejenigen Infektionen, die asymptomatisch verlaufen sind, als auch diejenigen von symptomatischen Patienten, die genesen sind. Serologische Tests sind in der Regel Bluttests, mit deren Hilfe festgestellt werden kann, ob Personen Kontakt mit einen bestimmten Erreger (in diesem Fall SARS-CoV-2) hatten und ob eine Immunantwort vorliegt. Die serologischen Tests können helfen, die tatsächliche Prävalenz in einer Population (SARS-CoV-2 Seroprävalenz) zu bestimmen, und zwar vor allem durch die Identifizierung von denjenigen Personen, die Antikörper gegen das Virus entwickelt haben. 

Grundsätzlich könnten validierte Antikörper-basierte Tests in mehrfacher Hinsicht wertvoll sein:

  • als einfache Tests, vor allem als Schnelltests (schneller und einfacher als PCR und nach deren diagnostischem Fenster, aber bisher kaum überzeugend validiert)
  • als quantitative Tests zum Erkennen eines Titer-Anstiegs in Serum von Akut- zu Rekonvaleszenz-Phase; das würde vor allem auch bei negativer PCR bei starkem Verdacht auf COVID-19 diese Diagnose (retrospektiv) stützen
  • in der Verlaufskontrolle, u.U. wichtig auch zur Einschätzung einer (temporären?) Immunität/ Einsatzbereitschaft von Gesundheitspersonal bzw. in der Deeskalation (‚lockdown‘-Aufhebung)

Letzteres würde aber erfordern, dass die Gegenwart von Antikörpern gegen SARS-CoV-2 Menschen tatsächlich gegen folgende Infektionen mit diesem Virus schützt. Laut WHO gibt es bislang (Stand 24. Mai 2020) aber noch keine Studie, die das belegt. Dies spricht auch derzeit gegen eine Ausgabe von „Immunitätspässen“ (Immunitätsnachweise) im Zusammenhang mit COVID-19.In der Frühphase der COVID-19 Erkrankung fallen die Antikörpertests (falsch-) negativ aus. Im Mittel braucht es eben 5-13 Tage bis zur Serokonversion für IgM-Antikörper. Antikörpertests haben dann als Zusatz zur PCR (siehe oben) eine Berechtigung bei der Diagnose bei Betroffenen mit typischer Symptomatik , wenn diese erst spät im Krankheitsverlauf vorstellig werden, so dass auf der einen Seite der Virusnachweis im Abstrich mittels PCR bereits abfällt, der Antikörpertiter aber bereits ansteigt. In solchen Fällen empfiehlt es sich mehrere Antikörpertests im Abstand von 7-14 Tagen durchzuführen.

Dagegen hat eine Testung gesunder Personen derzeit nur eine begrenzte Indikation, ist zudem sehr aufwändig, teuer und wenig aussagekräftig. Ob die Infektion bereits (unbemerkt) durchgemacht wurde, können die Tests wegen der hohen Rate falsch-positiver Befunde angesichts der geringen Prävalenz der Erkrankung in Deutschland derzeit nicht zuverlässig beantworten (siehe auch: https://www.arznei-telegramm.de/html/2020_06/2006042_01.html).

 

Es gibt grundsätzlich verschiedene Arten dieser serologischen Tests:

- Schnelltests 

Diese sind meist qualitative (positiv oder negativ) Lateral Flow Assays. Sie sind klein, tragbar (oft in Kassettenform) und in der Handhabung recht einfach. Ein Schnelltest kann als Point of Care-Test verwendet werden und liefert etwa 15 Minuten nach Applikation des Untersuchungsmaterials ein qualitatives Ergebnis. Diese Tests funktionieren je nach Anbieter mit Blut oder Abstrichmaterial bzw. Sputum. Die meisten dieser Schnelltests werden Antikörper (IgG und IgM) oder virales Antigen als Target haben. Derzeit sind bzw. kommen zahlreiche Tests auf dem Markt, die sehr unterschiedliche Qualität aufweisen. Einige sind nicht so validiert, wie es eigentlich der Fall sein sollte, zudem liegen derzeit noch keine verlässlichen Daten vor, die durch Vergleichsstudien belegen könnten, wie gut diese Schnelltests im Vergleich zu standardisierten laborbasierten Tests funktionieren.

- Enzyme-linked-Immunosorbent-Assay (ELISA)

Mit Hilfe dieser Testsysteme können qualitative oder quantitative Bestimmungen durchgeführt werden. Im Allgemeinen handelt es sich um einen Labor-basierten Test. Meist werden Vollblut-, Plasma- oder Serumproben von Patienten verwendet. Der Test stützt sich auf Mikrotiterplatten, die mit einem Virus-stämmigen Protein beschichtet sind, wie z.B. einem Spike-Protein. Patientenproben werden mit diesem Protein inkubiert. Wenn der Patient Antikörper gegen die viralen Proteine gebildet hatte, binden diese aneinander. Der gebundene Antikörper-Protein-Komplex kann dann in einem weiteren Schritt detektiert werden und zwar im Rahmen eines Waschschritts mit Antikörpern, wobei eine Färbung bzw. Fluoreszenz entsteht (im positiven Fall). Bei COVID-19 werden diese Tests wohl am häufigsten als Antikörpertests (IgA, IgG und IgM) angewandt werden. Die Sensitivität und Spezifität ist meist höher als bei den Kassettentests. Diese Testsysteme werden vor allem für den hohen Probendurchsatz im Labor angeboten. Auch Chemilumineszenz-Immunoassys (CLIA) zählen hierzu.

- Immunfluoreszenztests

Grundsätzlich kann auch ein indirekter Immunfluoreszenztest (IIFT) für spezielle Fragestellungen eingesetzt werden. Das Verfahren ist jedoch erfahrungsgemäß recht arbeitsaufwendig. SARS-CoV-2 Antigen exprimierende Zellen werden auf einem Objektträger mit Patientenserum und einem fluoreszenzmarkierten Antihuman-Antikörper inkubiert. Anschließend wird das Präparat mittels Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht. Der Nachweis von SARS-CoV-2-spezifischen IgA-, IgG- oder IgM-Antikörpern erfolgt über die Zugabe von fluoreszenz-markierten Anti-Human-Antikörpern nach Auswertung über die Fluoreszenzmikroskopie. Ein IIFT stellt zwar hohe Ansprüche an die technische Ausstattung und die Erfahrung der Mitarbeiter des Labors, bietet andererseits aber eine zumeist sehr hohe Sensitivität. Ein noch wesentlicherer Vorteil liegt in dem breiten Antigenspektrum der SARS-CoV-2-infizierten Zellen, im Gegensatz zum ELISA, wo zumeist ein einzelnes Antigen verwendet wird. Auf diese Weise können eine Vielzahl von verschiedenen Antikörperspezifitäten erfasst und eine hohe Trefferquote erzielt werden. Nach bisheriger Marktsichtung sind IIFT für den Nachweis von SARS-CoV-2 noch nicht erhältlich. 

 

Ein weiterer. unbedingt zu erwähnender Test, der jedoch Speziallaboratorien vorbehalten ist, ist der sogenannte Neutralisationstest:

- Neutralisationstest

Dieser Test zum Nachweis neutralisierender (protektiver) Antikörper beruht auf Patientenantikörpern, die eine Virusinfektion von ansonsten suszeptiblen Zellen in einer Zellkultur verhindern. Mit Hilfe von Neutralisationstests können die Wissenschaftler bestimmen, ob ein Patient Antikörper hat, die wiederum aktiv und effektiv gegen das Virus vorgehen. Diese Tests erfordern Vollblut, Serum oder Plasmaproben des Patienten. Neutralisationstests sind Zellkultur-basiert (in diesem Fall gemäß §5 BioStoffV in Laboratorien der Schutzstufe 3). Es bedarf also einer funktionierenden Zellkultur mit suszeptiblen Zelllinien wie beispielsweise Vero-Zellen (adhärent wachsende, permanent wachsende embryonale Affen-Nierenepithelzellen). Wenn in einer Versuchsreihe Viren und Zellen in Anwesenheit von abnehmenden Konzentrationen von Patientenantikörpern kultiviert werden, können Forscher die Menge der Antikörper im Patientenserum visualisieren und quantifizieren, wie viele Antikörper im Patientenserum die Virusreplikation verhindern können (serielle Verdünnungsreihe). Diese Verhinderung kann beispielsweise auf der Bindung des Antikörpers an wichtige Virusproteine, die für die Zellinfektion wichtig sind, beruhen: Sofern also spezifische neutralisationskompetente Antikörper im Patientenserum vorhanden sind, kommt es zur Ausbildung von Antigen-Antikörper-Komplexen. Anschließend wird das inkubierte Material auf eine suszeptible Zellkultur inokuliert und gemessen, inwieweit die Infektiosität des Virus durch die vorhandenen Patientenantikörper gehemmt (und damit das Virus neutralisiert) wird. Angegeben wird die höchste Verdünnungsstufe, bei der die Zellkultur noch keinen virusbedingten zytopathogenen Effekt (CPE) aufweist.

 

Kohmer et al. 2020